ImmuKnow法检测骨髓间充质干细胞诱导肾移植受者CD4+ T细胞的三磷酸腺苷水平

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.012

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (37): 5972-5976.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.012

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

ImmuKnow法检测骨髓间充质干细胞诱导肾移植受者CD4⁺ T细胞的三磷酸腺苷水平

陈书尚¹，蔡锦全¹，吴承耀¹，邓震¹，朱凌峰¹，周浩²，王庆华¹，谭建明¹

1解放军南京军区福州总医院泌尿外科，福建省福州市 350025
2福建中医药大学附属人民医院泌尿外科，福建省福州市 350004

修回日期:2014-08-19 出版日期:2014-09-03 发布日期:2014-09-03
通讯作者: 谭建明，博士，教授，博士后导师，解放军南京军区福州总医院泌尿外科，福建省福州市 350025
作者简介:陈书尚，男，1979年生，2008年解放军第二军医大学毕业，博士，主治医师，主要从事干细胞和器官移植的基础和临床研究。
基金资助:
福建省自然科学基金项目青年创新项目(2011J05089)；国家自然科学基金面上项目(81473496)

Effect of induction therapy with bone mesenchymal stem cells on adenosine triphosphate levels in CD4⁺ T cells determined by ImmuKnow assay in patients receiving renal transplantation

Chen Shu-shang¹, Cai Jin-quan¹, Wu Cheng-yao¹, Deng Zhen¹, Zhu Ling-feng¹, Zhou Hao², Wang Qing-hua¹, Tan Jian-ming¹

1Department of Urology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, Fuzhou 350025, Fujian Province, China
2Department of Urology, People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350004, Fujian Province, China

Revised:2014-08-19 Online:2014-09-03 Published:2014-09-03
Contact: Tan Jian-ming, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Urology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, Fuzhou 350025, Fujian Province, China
About author:Chen Shu-shang, M.D., Attending physician, Department of Urology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, Fuzhou 350025, Fujian Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2011J05089; National Natural Science Foundation of China, No. 81473496

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞在体内外均具有免疫调节能力，但其对肾移植受者体内CD4⁺ T细胞免疫状态的影响目前仍不清楚。
目的：探讨ImmuKnow检测技术对肾移植受者CD4⁺ T细胞免疫状态的监测作用及骨髓间充质干细胞诱导治疗对受者细胞免疫功能的影响。
方法：选择2011年1月至2013年6月于解放军南京军区福州总医院行同种异体肾移植并接受自体骨髓间充质干细胞诱导治疗的受者24例，以各项移植前指标匹配、接受巴利昔单抗诱导治疗的肾移植受者48例作为对照。两组受者分别于移植前、移植后第14，30，60，90，180天，以及在发生急性排斥或感染时抽取静脉血，以ImmuKnow法检测CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平。
结果与结论：移植后6个月内，骨髓间充质干细胞组急性排斥和移植后总感染发生率均低于巴利昔单抗组，但差异无显著性意义。两组受者移植后外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平均明显低于移植前(P < 0.05)，但两组之间比较差异无显著性意义。骨髓间充质干细胞组12例、巴利昔单抗组26例发生了移植后感染，这些受者发生感染时CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平均明显低于病情稳定时(P < 0.01)。结果表明骨髓间充质干细胞诱导治疗可有效降低肾移植受者的细胞免疫功能，而ImmuKnow法检测外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷含量可有效反映受者的细胞免疫状态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 移植, 三磷酸腺苷, 骨髓间充质干细胞, 肾移植, 免疫, 感染, 排斥, 巴利昔单抗, 诱导, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone mesenchymal stem cells have immunological regulation function both in vitro and in vivo, while the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on CD4⁺ T cell immune function in patients receiving kidney transplantation remains unclear.
OBJECTIVE: To explore the monitoring significance of CD4⁺ T-cell immune function by ImmuKnow assay and to determine the effect of induction therapy with bone marrow mesenchymal stem cells on cell immune function in patients receiving kidney transplantation.
METHODS: From January 2011 to June 2013, 24 patients receiving allograft renal transplantation with autologous bone marrow mesenchymal stem cells were included and another 48 patients receiving allograft renal transplantation and Simulect induction therapy with various matched preoperative characters served as controls. In both groups, adenosine triphosphate levels in CD4⁺ T cells in the peripheral blood were determined by the ImmuKnow assay preoperatively and at 14, 30, 60, 90, 180 days postoperatively, as well as during acute rejection and infection episodes.
RESULTS AND CONCLUSION: During the 180 days postoperatively, fewer patients in the bone marrow mesenchymal stem cell group had acute rejection and injection than the Simulect group, but no significant differences were observed. Postoperative adenosine triphosphate levels in CD4⁺ T cells were significantly lower than those determined preoperatively in both groups (P < 0.05), while no significant differences were observed between the two groups. A total of 12 patients in the bone marrow mesenchymal stem cell group and 26 patients in the Simulect group had infection episodes, and the adenosine triphosphate levels in CD4⁺ T cells during the infection episodes were lower than clinical stable patients in both groups (P < 0.01). For patients receiving renal transplantation, induction therapy with bone marrow mesenchymal stem cells can effectively decrease the cell immune function, which can be reflected by the adenosine triphosphate levels in CD4⁺ T cells in the peripheral blood determined by the ImmuKnow assay.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, kidney transplantation, adenosine triphosphate, immunity

中图分类号:

R394.2

陈书尚，蔡锦全，吴承耀，邓震，朱凌峰，周浩，王庆华，谭建明. ImmuKnow法检测骨髓间充质干细胞诱导肾移植受者CD4⁺ T细胞的三磷酸腺苷水平[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 5972-5976.

Chen Shu-shang, Cai Jin-quan, Wu Cheng-yao, Deng Zhen, Zhu Ling-feng, Zhou Hao, Wang Qing-hua, Tan Jian-ming . Effect of induction therapy with bone mesenchymal stem cells on adenosine triphosphate levels in CD4⁺ T cells determined by ImmuKnow assay in patients receiving renal transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 5972-5976.

图/表（结果） 2

2.1 移植后恢复情况 两组受者均手术成功。移植后随访6个月结果显示，两组受者存活率均为100%；肾功能延迟恢复发生率差异无显著性意义；骨髓间充质干细胞组急性排斥(经移植肾穿刺活检病理证实)发生率和移植后总感染发生率均低于巴利昔单抗组，但差异无显著性意义(P > 0.05)，所发生的感染包括上呼吸道感染、肺部感染、单纯疱疹病毒感染、胃肠道感染和尿路感染(表1)。

2.2 ImmuKnow法检测CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平 两组受者移植后第14，30，60，90，180天的外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平均明显低于移植前(P < 0.05)，但两组之间各相应时点比较差异均无显著性意义(P > 0.05，图1)。此外，移植后180 d内两组外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平并未随时间的延长而发生明显变化。

骨髓间充质干细胞组4例、巴利昔单抗组10例发生了急性排斥，这些受者排斥发生时的外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平高于自身及同组其他受者病情稳定时的外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平，但差异均无显著性意义[骨髓间充质干细胞组为(305.0±21.2) μg/L vs. (269.8±105.9) μg/L，P=0.640；巴利昔单抗组为(309.0±36.9) μg/L vs. (268.9± 93.4) μg/L，P=0.224，图2]。骨髓间充质干细胞组12例、舒莱组26例发生了移植后感染，这些受者发生感染时的外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平均明显低于自身及同组其他受者病情稳定时的外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平[骨髓间充质干细胞组为(180.0±20.2) μg/L vs. (269.8±105.9) μg/L，P < 0.01；巴利昔单抗组为(178.4±20.9) μg/L vs. (268.9± 93.4) μg/L，P < 0.01，图2]。

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引言

材料方法

设计：回顾性临床配对试验。

时间及地点：2009年1月至2013年6月在解放军南京军区福州总医院泌尿外科行同种异体肾移植并接受自体骨髓间充质干细胞或巴利昔单抗诱导治疗。

对象：

骨髓间充质干细胞组：选择2011年1月至2013年6月于解放军南京军区福州总医院行同种异体肾移植并接受自体骨髓间充质干细胞诱导治疗的受者。纳入标准：年龄18-50岁、首次移植、无输血史。排除标准：乙肝、丙肝、梅毒感染者。所有受者术前均签署接受骨髓间充质干细胞诱导治疗的知情同意书。

共入选24例，其中男18例，女6例；平均年龄(35.9±8.4)岁。供肾为尸肾者16例，亲属供肾者8例。原发病为肾小球肾炎10例，肾病综合征5例，多囊肾4例，糖尿病肾病2例，高血压肾病2例，狼疮性肾炎1例。移植后免疫抑制方案为霉酚酸酯+他克莫司(或环孢素A)+激素。

巴利昔单抗组：从解放军南京军区福州总医院移植数据库中选择2009年1月至2013年6月行同种异体肾移植并接受巴利昔单抗诱导治疗的受者，年龄、性别、体质量指数、原发病、移植前透析方式和时间、移植后免疫抑制方案分别与骨髓间充质干细胞组相匹配，按2∶1比例共入选48例。

方法：

免疫诱导方案：骨髓间充质干细胞组受者在接受肾移植前，先按本实验室已报道的方法制备自体骨髓间充质干细胞，保存备用^[2]。移植术中在肾动脉吻合结束前及移植术后2周分别经外周静脉输注(1.0-2.0)×10⁶/kg自体骨髓间充质干细胞。对照组分别于移植术前2 h和移植后第4天静脉滴注巴利昔单抗(诺华公司，批号：S1203)，总剂量 40 mg。

ImmuKnow法外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平测定：两组受者分别于移植前、移植后第14，30，60，90，180天，以及在发生急性排斥或感染时抽取静脉血2 mL，采用ImmuKnow^TM-Cylex免疫细胞功能测定试剂盒(美国Cylex公司)测定CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平。严格按说明书操作：微孔板上先加入25 μL稀释液和植物血凝素(PHA)刺激液各4孔，分别加入100 μL以1∶4稀释的待测血样后，于37 ℃、含体积分数为5% CO₂条件下共同孵育15-18 h，再加入50 μL CD4⁺磁珠液，室温下孵育15 min，通过分离磁架筛选出CD4⁺ T淋巴细胞，加入200 μL细胞裂解液振荡5 min，使细胞内的三磷酸腺苷释放。取50 μL至测量孔板，加入150 μL发光试剂，通过GloRunner微孔板化学发光仪(美国Cylex公司)检测并以Data Analysis CalculatorV 2.2软件分析三磷酸腺苷水平。

主要观察指标：两组肾移植受者的手术成功率、移植后存活率、肾功能恢复情况、急性排斥发生率、感染发生率、移植后第14，30，60，90，180天以及急性排斥和感染发生时的外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平。

统计学分析：数据使用SPSS 12.0软件处理。计量资料以x(_)±s表示，根据具体情况采用配对t 检验、独立样本t 检验或方差分析；计数资料以率表示，采用精确概率法检验或卡方检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

在移植免疫排斥反应中，T淋巴细胞起着重要作用，参与了移植抗原的识别、免疫调节、溶细胞效应等多层次免疫应答^[4]。辅助性T淋巴细胞(CD4⁺ T淋巴细胞)可分化为Th1细胞、Th2细胞、调节性T(Treg)细胞(CD4⁺CD25⁺)和Th17细胞等亚群。Th1细胞分泌白细胞介素1、肿瘤坏死因子β、γ-干扰素等细胞因子，主要参与细胞免疫；Th2细胞分泌白细胞介素4、白细胞介素5和白细胞介素10等细胞因子，主要参与体液免疫反应。在移植免疫排斥中，细胞免疫反应占主导地位；Th1细胞占优势可增强排斥反应，Th2细胞占优势能减弱或调节免疫应答^[4]。

骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的一类非造血干细胞，具有分化为多种组织细胞的潜能。近年来随着研究的逐步深入，发现除组织修复和再生功能外，骨髓间充质干细胞还具有免疫调节特性，可影响T淋巴细胞、B细胞、自然杀伤细胞、抗原提呈细胞等免疫细胞功能，减轻器官移植后免疫排斥，有望在移植免疫领域得到广泛应用^[5-8]。体外研究已经证实，骨髓间充质干细胞能够显著抑制由异体抗原、促有丝分裂剂和抗CD3和CD28抗体所引起的CD4⁺ T淋巴细胞增殖，使T淋巴细胞停留在G₀/G₁期^[1]。骨髓间充质干细胞通过调节CD4⁺ T淋巴细胞亚群的方式诱导免疫耐受：骨髓间充质干细胞可抑制CD4⁺ T淋巴细胞和CD8⁺ T淋巴细胞产生肿瘤坏死因子α和γ-干扰素，增加白细胞介素10和白细胞介素4的产生，调节Th1/Th2细胞亚群的平衡^[9]；在混合淋巴细胞培养体系中加入骨髓间充质干细胞，可诱导T淋巴细胞分化为Treg细胞，并促进Treg细胞增殖^[10]；此外，骨髓间充质干细胞尚可抑制Th17细胞亚群的分化^[10]。

骨髓间充质干细胞具有的上述免疫调节特性提示其有望诱导肾移植后的免疫耐受。研究证实，骨髓间充质干细胞在肾脏、心脏、胰腺/胰岛、肝脏等多种实体器官移植中均具有免疫抑制作用，可有效延长移植物的生存期，减轻免疫排斥反应^[11-14]。Perico等^[15]给2例亲属肾移植受者静脉输注骨髓间充质干细胞，结果发现移植后受者外周血的Treg细胞明显增多，而Treg可通过多种机制诱导和维持免疫耐受。本院在前期的一项前瞻性临床随机试验中，入选了105例活体捐肾的肾移植受者，在移植术中及移植术后2周分别输注(1.0-2.0)×10⁶/kg自体骨髓间充质干细胞。移植后1年的随访结果发现，与巴利昔单抗诱导组相比，自体骨髓间充质干细胞输注能显著降低肾移植后急性排斥反应和机会感染的风险，促进肾功能恢复，表明了骨髓间充质干细胞在体内具有诱导免疫耐受的能力^[2]。但骨髓间充质干细胞对肾移植受者体内免疫功能的具体作用尚未见报道。

由于骨髓间充质干细胞可调节CD4⁺T淋巴细胞亚群增殖和功能，诱导免疫耐受^[9-10,15]，因此监测骨髓间充质干细胞诱导治疗后肾移植受者术后外周血CD4⁺ T淋巴细胞的功能状态有助于了解骨髓间充质干细胞对移植受者体内细胞免疫功能的具体影响。Cylex公司设计的ImmuKnow试剂盒是通过三磷酸腺苷量化等技术来检测CD4⁺ T淋巴细胞的免疫反应能力，可反映移植受者的免疫状态，是评价受者免疫功能的有效指标^[3,16-22]。

本研究发现，肾移植后受者在诱导治疗及移植后常规三联免疫抑制剂作用下，外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平均明显低于移植前，提示受者细胞免疫功能得到有效抑制。而骨髓间充质干细胞组和巴利昔单抗组受者移植后第14，30，60，90，180天的外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平比较均未见明显差异，提示骨髓间充质干细胞与巴利昔单抗均可有效用于同种异体肾移植的诱导治疗，与其他研究结论一致^[2]。

感染是肾移植受者术后面临的主要问题之一。有研究认为监测移植后受者CD4⁺ T淋巴细胞的三磷酸腺苷水平能有效反映移植后免疫状态，可用于预测感染发生^[3,16-22]。本研究发现，肾移植后受者发生感染时，CD4⁺ T淋巴细胞的三磷酸腺苷水平显著降低。虽然受者三磷酸腺苷水平处于正常范围时也可能发生感染，但三磷酸腺苷水平降低时极易发生感染，需进一步采取措施^[16-18]。本研究结果提示采用ImmuKnow法检测外周血CD4⁺T淋巴细胞的三磷酸腺苷水平可作为预测感染可能发生的指标，与课题组前期的研究结果一致^[19]。

关于CD4⁺ T淋巴细胞的三磷酸腺苷水平检测能否用于器官移植后预测排斥发生还存在争议。在王凯等^[20]的研究中，他们发现肝移植术后排斥组CD4⁺T淋巴细胞三磷酸腺苷值明显高于非排斥组，认为检测外周血CD4⁺T淋巴细胞的三磷酸腺苷水平对肝移植后排斥的预测和防治有重要意义。本研究中受者发生急性排斥时，外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平虽然高于病情稳定时的外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平，但差异无显著性意义。本研究两组受者只有11例发生了急性排斥，样本偏小可能影响了统计结果。而肾移植Torio等^[21]发现肾移植受者发生感染时CD4⁺ T淋巴细胞三磷酸腺苷值明显降低，但发生急性排斥时与病情稳定时的CD4⁺ T淋巴细胞三磷酸腺苷值并没有明显差异。De Paolis等^[22]的研究也显示肾移植受者高ImmuKnow检测值与急性排斥的发生并不存在相关性。作者在先前的研究中发现老年肾移植受者发生急性排斥时与病情稳定时相比，CD4⁺ T淋巴细胞三磷酸腺苷值同样没有明显差异。结合文献和本研究结果，作者认为，虽然肾移植后受者细胞免疫功能增强时容易发生急性排斥，但单纯采用ImmuKnow法检测外周血CD4⁺ T淋巴细胞的三磷酸腺苷水平并不能准确预测肾移植后急性排斥的发生。目前国内外均有报道多种细胞因子在预测肾移植后急性排斥中的作用^[23-24]。虽然这些指标的特异性有待更多的临床研究证实，但细胞因子作为调节免疫应答的重要介质，在免疫排斥反应的初期即可出现明显变化，如果能将这些指标与CD4⁺T淋巴细胞三磷酸腺苷水平以及受者的尿量变化、移植肾彩超结果等结合起来分析，将有望尽早发现急性排斥预测，是值得将来重点研究的方向之一。

综上所述，本研究结果提示，骨髓间充质干细胞诱导治疗可有效降低肾移植后受者的细胞免疫功能，而ImmuKnow法检测外周血CD4⁺ T细胞三磷酸腺苷水平可有效反映骨髓间充质干细胞诱导治疗对受者细胞免疫状态的影响。此外，ImmuKnow法检测结果可作为预测肾移植后感染可能发生的预警指标，但可能无法准确反映肾移植后急性排斥的发生。试验入选的样本量较少是主要局限性之一，在今后的研究中将进一步扩大样本量，得出更加完美的实验结果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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间充质干细胞在诱导肾移植术后免疫耐受方面具有非常好的应用前景。谭建明等^[1]的前瞻性临床随机试验表明，自体间充质干细胞输注能促进移植肾功能恢复，减少不良事件和机会感染，可替代巴利昔单抗，减少术后免疫抑制剂用量。Perico及其同事^[2-4]在动物和人体的研究表明，间充质干细胞移植时机的选择至关重要。在肾移植后7 d行间充质干细胞移植，会诱发移植肾炎症反应，导致移植肾失功^[2]；而在肾移植前行间充质干细胞移植，可延长移植肾存活时间^[3]。间充质干细胞诱导肾移植术后免疫耐受的机制尚未完全阐明。他们还发现间充质干细胞的体内免疫调节作用与其促进Treg增殖有关^[4]。Ge等^[5]的研究表明，间充质干细胞在体内促进Treg增殖，与间充质干细胞表达的吲哚胺2,3-双加氧酶有关。这些研究为间充质干细胞在诱导肾移植术后免疫耐受的临床应用奠定了基础。

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ImmuKnow法检测骨髓间充质干细胞诱导肾移植受者CD4⁺ T细胞的三磷酸腺苷水平

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[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	袁家威, 张海涛, 揭珂, 曹厚然, 曾意荣. 基于网络药理学研究桃红四物汤治疗假体周围感染的潜在靶点和机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1428-1433.
[4]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[5]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[6]	李嘉程, 梁学振, 刘金豹, 许波, 李刚. 骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1212-1217.
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[12]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[13]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[14]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[15]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.

ImmuKnow法检测骨髓间充质干细胞诱导肾移植受者CD4+ T细胞的三磷酸腺苷水平

Effect of induction therapy with bone mesenchymal stem cells on adenosine triphosphate levels in CD4+ T cells determined by ImmuKnow assay in patients receiving renal transplantation

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ImmuKnow法检测骨髓间充质干细胞诱导肾移植受者CD4⁺ T细胞的三磷酸腺苷水平

Effect of induction therapy with bone mesenchymal stem cells on adenosine triphosphate levels in CD4⁺ T cells determined by ImmuKnow assay in patients receiving renal transplantation